Trzymaj je ZIMNE! Proces tworzenia kompetentnych komórek jest trudny ze względu na potrzebę zachowania zimna komórek. Jest to kluczowe, ponieważ komórki są tak wrażliwe i kruche, gdy stają się kompetentne Utrzymywanie niskiej temperatury pomaga uniknąć śmierci komórek podczas przetwarzania.
Dlaczego reakcje są utrzymywane na lodzie podczas eksperymentu z transformacją?
Mieszanka plazmid-komórka jest następnie krótko podgrzewana do 45–50°C, pozwalając DNA na wejście do komórki przez rozerwaną błonę. Ogrzana mieszanina jest następnie umieszczana z powrotem na lodzie aby zatrzymać plazmidy wewnątrz bakterii … Jeśli roztwór plazmidowego DNA zawiera zbyt dużo soli, może wystąpić wyładowanie łukowe, które utrudnia transformację.
Dlaczego umieszczasz probówki na lodzie?
Jak myślisz, dlaczego kładziemy rurki na lodzie? Aby wprowadzić DNA do bakterii, musimy przedziurawić je chemicznym chlorkiem wapnia (CaCl2). … Dziury wbite w DNA pozostawiają bakterie nieszczelne. Jeśli nie będziemy trzymać ich w lodzie, „wykrwawią się” na śmierć.
Jaka jest rola lodowatego chlorku wapnia w przygotowaniu kompetentnych komórek?
Proces transformacji szoku cieplnego chlorkiem wapnia zachęca komórki bakteryjne do pobierania DNA z otaczającego środowiska. … Lodowaty roztwór CaCl2 ułatwia wiązanie DNA z powierzchnią komórki, która następnie wchodzi do komórki po krótkim okresie szoku cieplnego (3).
Jak przechowywać właściwe komórki?
Właściwe ogniwa powinny być przechowywane w - 80°C. Przechowywanie w -20°C spowoduje znaczny spadek wydajności transformacji (TE). Podczas testów na NEB 5-alfa Competent E. coli (NEB C2987H) komórki straciły 94,5% TE już po 24 godzinach przechowywania w -20°C.
